單分子質量光度系統—TwoMP

單分子質量與組分分析

質量光度法（Mass Photometry）是一種革命性的分析生物分子的新方法，即超微量單分子質量和分布測量分析法。它能夠在溶液中精確測量單個分子的質量，不需要任何偶聯固化或者標記標簽，在天然狀態下，完成對生物分子的分析。這種方法為生物分析和生物分子功能研究開辟了新的可能性。

★  無標記修飾；

★  保持結構完整性和活性； 

★  測量只需要幾微升的樣品；

★  設計緊湊的臺式儀器，無特殊安裝要求；

★  軟件自動控制采集過程，并在幾分鐘內進行質量分析；

★  直觀地解釋質量分布的結果，而不需要任何經驗和知識；

★  準確測量在溶液（而不需真空）中的蛋白分子質量；    

★  單分子分析，可靠區分樣品中所有已知和未知組分，高精度捕獲高豐度和低豐度分子；

★  快速、簡單、最小樣本量：納米濃度下的微升樣品體積，幾分鐘內獲得結果，寬質量范圍和高動態范圍；

這么優秀的分子分析技術，您還不動心么？

質量光度法Mass photometry的技術背景：

質量光度學建立在干涉反射顯微鏡和干涉散射顯微鏡的原理之上。牛津大學的Kukura教授團隊證明了單分子在觀察界面上散射的微小光量能夠被可靠地檢測到，可以用于計算溶液中的分子數量，更重要的是，它與分子質量直接相關，可以用于測量分子的質量。

2018年，牛津大學的Philipp Kukura團隊宣布他們開發的一種全新技術：質量光度法（Mass photometry），通過單分子散射光的方式測量單分子的質量。這種方法提可以精確測量溶液中單個分子的質量——處于原始狀態、無需標記，提供了一種新的分析生物分子的方法，為生物分析和研究生物分子的功能開辟了新的途徑。牛津大學（University of Oxford）迅速將其業務剝離出來，成立了英國Refeyn公司，并推出質量光度系統（單分子質量分析系統）。

圖1：質量光度法原理。附著在測量界面上的分子散射的光干擾了該界面反射的光。干涉對比度與質量成線性關系。
 

英國Refeyn公司的質量光度系統One MP于2019年3月上市，2020年進入中國市場，2021年，推出更新型號的產品---質量光度系統的二代機，Two MP，在硬件和軟件上均有升級。2022年2月，北京佰司特中標北京生命科學研究所質譜招標采購項目（一臺質量光度系統二代機）TwoMP，其分辨率和穩定性，相對之前的質量光度系統的一代機OneMP，有大幅提升。北京佰司特借此機會，也為國內科研人員提供更有更好的產品和服務。

2021年開始，北京佰司特科技有限責任公司獲得中國大陸地區的代理權；2023年開始，北京佰司特科技有限責任公司負責英國Refeyn公司的質量光度系統在國內研究單位的市場推廣、產品宣傳、銷售和售后工作。

全新的英國Refeyn公司的單分子質量光度系統—TwoMP，將質量光度法（Mass photometry）技術引入到日常的實驗室中，以超高的靈敏度、速度、準確度和簡單性來表征你感興趣的分子，是監測蛋白質純化、優化樣品、研究蛋白質功能和相互作用的理想儀器。所有測量都可在各種各樣的天然緩沖液中逐個分子地完成，還不需要標簽，就可以直觀地解釋質量分布結果，且無需任何先驗知識。

粒子散射的光與粒子體積和折射率成線性關系。由于蛋白質的光學性質和密度只有百分之幾的變化，它們的散射信號與它們的序列質量成正比，這使得在高精度和大質量范圍內用光來“稱量"單個分子成為可能。許多生物分子（糖蛋白、核酸或脂類）的散射信號與質量的相關性是成立的，使得質量光度法能夠成為溶液中生物分子的通用分析工具。     

圖2：質量光度法測量溶液中蛋白質和蛋白質組合的分子質量。通過校準，質量光度法可以高精度（平均2%）測量未知物質的質量。

質量光度法Mass photometry的技術路線：

質量光度法（一）-iSCAT法觀察單個分子
質量光度法（MP法）是一種基于iSCAT法的單分子觀察方法。
如果您從樣品底部照射激光束并預先聚焦載玻片的上表面，您將觀察到來自載玻片的反射光。
如果在觀察這種狀態時被測物體（蛋白質分子等）與載玻片接觸，則折射率只會在該部分發生局部變化，并且來自被測物體的散射光也會被檢測到。
在普通顯微鏡模式下無法觀察到這種現象，但可以通過執行 SNR（短噪聲限制信噪比）分析來捕獲圖像。

質量光度法（二）-SNR分析處理
為了從獲取的原始圖像中去除噪聲，取原始圖像之間的差異并進一步去除噪聲。
這個工作叫做SNR（Short-noise limited信噪比）分析（其實也是多幀合并）。
幀數約為每秒100幀，并不斷進行分析。
一旦檢測到測量對象，它將被覆蓋并且不計入下一幀。

質量光度法（三）-分子計數
取決于散射強度的圖像對比度是從測量對象的捕獲圖像中獲得的。此時，通過圖像分析確定對比度區域，而不是平均對比度，并計算總量。
自動保存每幀獲取的測量對象圖像的“數量"和“總對比度"。保存的數據可以擴展為“對比數"分布。

質量光度法（四）-對比分子量轉換
獲得的對比度總量與其分子量成線性比例。
通過測量已知分子量的樣品，創建校準曲線并使用它，對比度將轉換為分子量。

質量光度法Mass photometry技術的特點：

      ★  準確測量蛋白分子在溶液中的真實、天然行為；
      ★  適用于在各種緩沖液中，與膜蛋白相容；
      ★  無標簽標記，無需修飾樣品或干擾分子表面；
      ★  可檢測樣本中所有亞群體的信息：單分子分析能夠可靠地區分已知和未知樣品成分，無需先驗知識；
      ★  單分子計數：以高精度捕獲高豐度和低豐度分子；
      ★  寬質量范圍和高動態范圍；

      ★  一種分析形式可提供多個結果；
      ★  保持同質性、結構完整性和活性；
      ★  快速、簡單、最小樣本量：納摩濃度下，微升體積，幾分鐘內獲得結果；

質量光度系統TwoMP儀器的特點：

      ★  緊湊的臺式儀器，安裝要求低。測量只需要幾微升的樣品、和干凈、高質量的蓋玻片，幾分鐘內可獲得結果；
      ★  直觀高效——軟件自動控制采集過程，并在幾分鐘內完成質量分析。您可以直觀地解釋質量分布結果，而無需任何先驗知識；
      ★  精確性——由于其高靈敏度，非常適合在生理（低）濃度下進行測量，而單分子計數技術固有的高動態范圍確保低豐度分子仍能被準確捕獲。質量光度法能輕松量化不同種類的蛋白質分子，具有高分辨率和重復性；
   

質量光度系統TwoMP儀器的參數：

※ 原理：干涉光散射，無需標記

※ 質量范圍：30kDa – 5MDa

※ 測量精度：±2% @ 10 nM

※ 單次測量質量誤差：±5% @ 10 nM

※ 分辨率（FWHM）：25kDa @ 66kDa，60KDa @ 660 kDa

※ 濃度范圍：100pM - 100nM（粒子濃度）

※ 靈敏度：< 1ng蛋白質

※ 樣品體積：5 - 20 μ l

※ 幀率（標準設置）：1 kHz（原始），100 Hz（集成）

※ 視場：4 x 11µm （@ 500 Hz）至12 x 17µm（@ 135 Hz）

※ 波長：488 nm

※ 像素尺寸：12nm

光學方法檢測大分子的分子量

※ 測量的分子量范圍廣泛，從 30 kDa 到5MDa

※ 蛋白質寡聚化/片段化

※ 抗原抗體反應、化學計量學參數

※ AAV等病毒載體的滿載/空載比

※ DNA Ladder的分子量、多糖的分子量

天然狀態下快速完成測量

※ 兼容各種溶液

※ 無需標記，無需固定、無需樣品前處理

※ 測量過程儀器與樣品非接觸

※ 整個測量過程只需要幾分鐘

樣品需求量非常少

※ 蛋白質（<1 MDa）：1 nM 至 2 μL，<1 ng

※ 病毒載體（> 1 MDa）：0.1 nM 至 2 uL

 應用領域：

      ★  樣品表征 Sample characterization；

樣品的純度和穩定性是成功的生化和結構研究的關鍵因素。在制藥生產的背景下，蛋白質的純度是特別重要的，特別是隨著蛋白質類產品如生物制劑的日益流行。

質量光度系統提供了在單個分子水平上樣品異質性的快速評估，使用最小的樣品體積和在幾分鐘內。通過質量光度系統獲得的質量分布提供了樣品中現有物種的直接信息，由于條件變化而產生的任何變化都可以用于樣品優化。

      ★  蛋白質的寡聚化 Protein oligomerization；

許多生物系統的一個關鍵特征是蛋白質自組裝成特定的四級結構，這往往決定和調節它們的功能。蛋白質低聚化的評估對于詳細了解復雜的生物過程是至關重要的。在這種情況下，分子質量是一個重要的參數，因為它作為低聚化的直接度量。

質量光度系統提供了高分辨率的分子質量分布與單分子靈敏度。這使得我們的技術能夠有效地檢測出占主要樣本總數不到1%的稀有物種。

      ★  大分子組裝 Macromolecular assemblies；

在分子自組裝中，分子或分子的一部分在沒有外部因素的情況下自發形成有序結構。大分子組合包括多種蛋白質，而且通常包含其他分子，如DNA、RNA、糖和/或脂類。大分子復合物在細胞內的組裝是一個高度調控的多步驟過程。質量光度系統能夠高效、準確地表征這些復雜的粒子，使新型超分子結構的工程具有巨大的醫學研究潛力。

      ★  生物分子間相互作用 Biomolecular interactions；

生物分子之間的相互作用在每個生物過程中起著關鍵作用。質量光度系統非常適合于定量低濃度下的相互作用，其主要優點是檢測溶液中存在的生物復合物。分子質量是反映生物分子和生物分子復合物的同質性、結構完整性和活性等多種性質的通用讀數。這使得質譜光度法不僅可以用于簡單的純度測定，還可以用于活性和結合性評估，提供了獨特水平的數據完整性和其他類似技術的可比性。

用戶評價

質量分布是蛋白質樣品相對純度和穩定性的基本特征，可作為蛋白質純度、復雜組裝、聚集或各種緩沖液中蛋白質-蛋白質相互作用的直觀讀數。監測質量可以指導緩沖條件的優化，避免蛋白質聚集或促進蛋白質復合物的穩定性和組裝。單分子水平上的質量測量為分子相互作用的穩態分析提供了一種直接的方法。由于其高靈敏度，質量光度系統TwoMP非常適合在生理（低）濃度下進行測量，而單分子計數技術固有的高動態范圍確保低豐度分子仍能被準確捕獲。

英國Refeyn公司營銷官Matthias Langhorst表示，該工具的應用范圍從簡單的純度檢測（質量峰的數量可顯示樣本中有多少種蛋白質），到更復雜的分析，例如在不同條件下分析生物分子組裝行為等。

在麻省理工學院研究細胞核孔復合體的Thomas Schwartz是該裝置的早期測試者，他一聽說質量光度系統就聯系Kukura：“這臺儀器有價值的地方在于，我們可以觀察復雜的蛋白質-大分子復合物，找出混合物中的成分，是否能檢測出任何與穩定性有關的問題。"“在典型的工作流程中，這是一個非常耗時的過程。"

“這些原理并不新鮮，但這種新裝置的實現非常聰明和強大，因為它可以測量一個場中的每一個粒子。非常強大，具有潛在的革命性。"